前言 乙型肝炎病毒（HBV）感染是危害人类健康的严重问题之一，目前全世界慢性HBV感染者至少有3.5亿人[1]，我国有1亿多HBV携带者[2]。HBV主要经血和血制品、母婴、破损的皮肤黏膜及性接触传播。HBV可分为A、B、C、D、E、F、G、H共8个基因型，其中B和C基因型是中国最常见的基因型，南方地区以B基因型为主，北方地区以C基因型为主[3,4]。 HBV是含有部分单链区的双链环状DNA病毒，其基因组全长约3.2kb。HBV包含4个开放读码区（ORF），分别为胞膜蛋白基因区（即S基因区，其又由preS1、preS2和S组成），衣壳蛋白基因区（即C基因区，其又由preC和C组成），聚合酶基因区（P基因区）及X基因区。HBVS区编码的S蛋白是构成乙肝表面抗原（HBsAg）的主要蛋白。HBsAg是HBV感染后出现最早的血清学标志物，也是临床诊断HBV的主要标志物[5]。血清HBsAg阴性者的肝组织或血清中仍可检出HBVDNA（排除急性期和窗口期感染），这种现象称为隐匿性HBV感染(OBI)。隐匿性HBV感染者血清HBsAg检测为阴性，对输血安全、临床诊断和流行病学监控带来很大困难。OBI的发生机制非常复杂，至今尚未完全阐明，基因突变在OBI的发生发展中具有十分重要的作用[6]。其中，HBVS区突变可以影响HBsAg的抗原性、免疫原性、分泌和表达水平，从而影响血清中的HBsAg的检测[6-9]。目前，研究最多并得到证实的OBI相关突变是GR[10-16]，该位点最早在年被报道，随即逐渐被进一步证实[10-16]。近些年来，隐匿性HBVS蛋白中的一些新型突变也逐渐被发现并被证实[17-22]。 本研究发现了10个与OBIB基因型相关的突变位点（E2G、QR、KR、MT、DE、GR、VA、SN、LS和IS）（Table1），其中E2G、VA和I是新发现的OBIB基因型相关点突变。为了进一步验证这些突变位点与OBI相关性，尤其是新发突变对HBsAg表达的影响，本研究构建了中国地区保守的1.3倍HBV全基因表达载体（pHBV1.3B），并在pHBV1.3B基础上对HBVS区进行定点诱变改造（S区以外的基因区保持不变），构建了10个含且仅含目的突变基因的表达载体。经细胞转染实验证实，E2G、DE、GR、VA和SN显著降低了HBsAg的细胞外水平（Figure1）。在这些突变中，E2G和VA是首次发现并进一步在细胞水平得到验证的新型OBI相关突变。 值得注意的是，E2G的细胞外HBsAg（3.8%VSpHBV1.3B）和细胞内HBsAg（.3%VSpHBV1.3B）都与pHBV1.3B有显著性差异（P0.），呈现出明显的HBsAg分泌受阻的特征（Figure1,A）。免疫荧光结果显示，在pHBV1.3B转染的细胞中，HBsAg在整个细胞质中呈弥散均匀的、细颗粒状广泛分布。相比之下，E2G转染的细胞中，大多数的细胞HBsAg呈现出片状高密度分布在细胞核附近甚至整个细胞质，少数细胞HBsAg呈现出粗颗粒状的分布于细胞质中（Figure2,A）。片状高密度和粗颗粒状分布均表现出HBsAg细胞内淤积的特征，片状高密度分布比粗颗粒状的分布HBsAg淤积程度更加明显。免疫荧光光密度分析结果显示：E2G转染的细胞表达HBsAg荧光光密度（中位数，0.IOD/pixel）明显高于pHBV1.3B（中位数，0.IOD/pixel）（P0.）（Figure2,B）。证明E2G这种新型的OBI相关的突变可以引起HBsAg分泌受阻，从而导致HBsAg细胞内淤积和分泌减少，初步阐明了E2G突变引起OBI的机制。 HBV前基因组RNA在逆转录过程中，由于聚合酶/反转录酶缺少核酸外切酶校正功能，使其复制过程容易出现一个或多个核苷酸的变异，因此HBV的变异率要高于一般的DNA病毒[23]。一些自然发生的HBV突变，包括preC/C基因、核心启动子突变和S基因缺失突变具有一定的临床和流行病学意义[24-26]。因此，在HBV突变研究中选择保守的HBV载体尤为重要。我们将1.3倍全长（nt-/1-）的HBVB基因型全基因标准参考序列（GQ）连接到pcDNA3.1载体上,构建了保守型HBVB基因型全基因表达载体（pHBV1.3B）。1.3倍的全长HBV基因组完整包涵了HBV病毒的四个开放阅读框架（PreS/S区、Pre-C区、P区、X区），以及增强子和启动子等关键基因结构。虽然本研究中使用的HBV标准参考序列是完全合成的，但之前的研究[27]已经验证了该合成的基因在细胞实验和动物实验中具有完全的复制和表达能力。使用pHBV1.3B作为对照可以消除HBV基因组中潜在突变位点对HBV复制以及HBsAg表达的影响，从而更全面的分析目的突变基因的功能。 Table1.ComparisonoftheOBI-relatedmutationswiththecontrolgroup. ThenucleotidesequencesofHBVSregioninthecontrolgroupwerealignedandtranslatedintoaminoacidsequence.TheconsensussequenceofSproteininthecontrolgroupwasderivedasstandardreferencesequencefor
